• 免疫印迹技术

    • 空腹检查:
     
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  • 综述

    免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测, 具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点,是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法,如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。

    不适宜人群

    暂无相关资料

    注意事项

    不适宜人群:无

    检查时禁忌:无

    检查时禁忌:1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

    2、显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2。

    3、DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。

    指标结果解读

    正 常

    无特殊显色反应。

    异 常

    异常结果:有特殊显色反应,证明有某种蛋白质存在。 需要检查人群:检查某种蛋白。

    检查过程

    (一)蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。

    (二)电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。

    (三)转移:(半干式转移)

    1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。

    2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。

    3、转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2,转移1.5hr。转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比。

    (四)免疫反应:

    1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。

    2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr。

    3、弃包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。

    4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。

    5、弃一抗和1%BSA,用0.01M PBS分别洗膜,5min×4次。

    6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr。

    7、弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。

    8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

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最新更新:2014-05-06

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